EGY48 Chemically Competent Cell  酵母感受態(tài)細(xì)胞

基因型：

MATα, ura3, his3, trp1, LexAop (x6)-LEU2

簡(jiǎn)要說(shuō)明：

EGY48菌株是LexA系統(tǒng)酵母雙雜實(shí)驗(yàn)用菌株，MATα型，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒驗(yàn)證蛋白互作或篩庫(kù)；Transformation marker為：his3，trp1,ura3，報(bào)告基因?yàn)椋篖EU2；報(bào)告基因UAS (上游激活序列)來(lái)源于LexA op(x6)，只有當(dāng)Bait和Prey互作時(shí)才能啟動(dòng)LEU2表達(dá)。EGY48-LexA系統(tǒng)有三種配套質(zhì)粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ。質(zhì)粒pLexA篩選標(biāo)志為HIS3，用于表達(dá)DNA-BD與目標(biāo)蛋白(Bait)的融合蛋白；質(zhì)粒pB42AD篩選標(biāo)志為T(mén)RP1，用于表達(dá)AD與目標(biāo)蛋白(Prey)的融合蛋白；報(bào)告質(zhì)粒p8op-LacZ篩選標(biāo)志為URA3，報(bào)告基因?yàn)長(zhǎng)acZ，報(bào)告基因UAS來(lái)源于LexAop(x6)，只有當(dāng)Bait和Prey互作時(shí)才能啟動(dòng)LacZ表達(dá)。EGY48感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pGBKT7質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>104 cfu/μg DNA

操作說(shuō)明：

1. 取pBait-AbAi質(zhì)粒5µg，BstBI或 BbsI酶切1h，回收；

2. 取一支無(wú)菌的1.5ml EP管，依次加入預(yù)冷的預(yù)冷的線性pBait-AbAi質(zhì)粒1-5 µg（體積不高于15 µl），Carrier DNA(95-100 度5min 快速冰浴，重復(fù)一次)10µl，100µl冰上融化的Y1HGold感受態(tài)細(xì)胞，PEG/LiAc 500µl，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次；

3. 30℃水浴30min，每10min輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次；

4. 每支加入20µl的二甲基亞砜（用以提高轉(zhuǎn)化效率，可不做）；

5. 42℃水浴15min，每5min輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次；

6. 12000rpm瞬時(shí)離心棄上清，每支加入1ml的YPD Plus（YPDA）于30℃復(fù)蘇1h（用以提高轉(zhuǎn)化效率，可不做）；

7. 12000rpm瞬時(shí)離心棄上清，用100µl 0.9% NaCl重懸，涂板，30℃培養(yǎng)48-96h。

注意事項(xiàng)：

1.PEG在低溫下易析出，請(qǐng)?jiān)诔叵聎an全溶解后使用。

2.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

3.同時(shí)轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時(shí)可增加質(zhì)粒的用量。

4.Y1HGold酵母菌株對(duì)高溫敏感，最適生長(zhǎng)溫度為27-30℃；高于31℃，生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。

5.菌落變粉不是污染，是酵母細(xì)胞生長(zhǎng)中一個(gè)常見(jiàn)現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過(guò)自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，Y1HGold的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylaminoimidazole（AIR）在細(xì)胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。

6.酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度比YPDA培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長(zhǎng)越慢，以轉(zhuǎn)化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48h培養(yǎng)可見(jiàn)直徑1mm克隆；涂SD單缺平板29℃，48-60h培養(yǎng)可見(jiàn)直徑1mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80h培養(yǎng)可見(jiàn)直徑1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培養(yǎng)可見(jiàn)直徑1mm克隆。